用基因工程對T淋巴細(xì)胞進行改造可以將它們轉(zhuǎn)變?yōu)閺娪辛Φ膭?chuàng)新抗癌藥物。25年以來，基于細(xì)胞工程和工藝制造的進步，T細(xì)胞療法極大地改善了難治性癌癥患者的療效。其中最引人注目的案例之一就是CD19 CAR－T療法。CAR－T療法是在T細(xì)胞表面表達嵌合抗原受體 （chimeric antigen receptor， CAR），改變淋巴細(xì)胞的特異性和功能。靶向CD19的CAR在治療B細(xì)胞癌變導(dǎo)致的血癌方面已經(jīng)表現(xiàn)出良好的療效。Kite Pharma和諾華公司的CD19 CAR－T細(xì)胞療法都有望在今年獲得FDA的批準(zhǔn)上市。CD19 CAR－T治療在一些白血病和淋巴瘤中的成功，有望將CAR－T細(xì)胞療法應(yīng)用到其他惡性腫瘤領(lǐng)域。一系列新型靶抗原和CAR設(shè)計正在開發(fā)當(dāng)中，即將在血液和實體瘤中進行測試。此外，自體T細(xì)胞是目前基于細(xì)胞的癌癥免疫治療的重點，但同種異體細(xì)胞來源，包括干細(xì)胞衍生的“現(xiàn)成”T細(xì)胞，將在未來起到重要作用。最近，《自然》雜志對工程T細(xì)胞療法的近況和發(fā)展方向進行了盤點。我們在本文中帶來詳細(xì)解讀。

工程T細(xì)胞原理

T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育時會獲得稱為T細(xì)胞受體（T cell receptor， TCR）的抗原受體。在生理條件下T細(xì)胞對抗原的識別由TCR－CD3復(fù)合體完成。TCR由α和β鏈組成，它們的結(jié)構(gòu)決定了TCR的抗原特異性。CD3包括γ、δ、ε和ζ四種亞基，它的作用是啟動T細(xì)胞激活程序。

▲T細(xì)胞受體（TCR）結(jié)構(gòu)（圖片來源：《自然》）

工程T細(xì)胞最自然的方式是利用基因工程在T細(xì)胞中表達針對特定抗原的TCR，它們與CD3形成復(fù)合體后，能夠給予T細(xì)胞特定的抗原特異性。運用基因工程在T細(xì)胞中表達TCR可以產(chǎn)生大量在表型上與身體自然產(chǎn)生的T細(xì)胞相同的T細(xì)胞。對于那些自身無法產(chǎn)生足夠免疫反應(yīng)來對抗腫瘤或其它疾病的患者來說，這些抗癌或抗病毒的T細(xì)胞可以起到增強免疫反應(yīng)的作用。目前這一策略的實施重點在于分離出具有最好特異性和親和力的TCR，設(shè)計分子機制來防止TCR的交叉反應(yīng)性（cross－reactivity），和減少α和β鏈之間發(fā)生的錯配。TCR－T細(xì)胞療法在治療黑色素瘤 （melanoma） 和肉瘤 （sarcoma） 患者的小型臨床試驗中已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的抗癌效果。

另外一種讓T細(xì)胞識別新抗原的方法是通過設(shè)計針對抗原的人工受體。這種人工受體的細(xì)胞內(nèi)片段通常需要CD3ζ鏈來保證該受體能夠啟動T細(xì)胞激活程序。第一代的CAR設(shè)計將CD3ζ鏈與能夠識別抗原的抗體片段融合在一起，但是這種CAR設(shè)計在實驗中不足以激發(fā)足夠強大的免疫反應(yīng)。目前的第二代CAR設(shè)計在人工受體中結(jié)合了T細(xì)胞共刺激 （co－stimulating） 信號受體。這種將T細(xì)胞激活片段（CD3z鏈） 和共刺激受體片段 （最常見的是CD28） 結(jié)合在同一CAR上的設(shè)計可以讓T細(xì)胞不但能夠識別特定抗原，而且可以分泌白介素－2 （interleukin－2） 并且在重復(fù)接觸抗原后分裂增殖。二代CAR設(shè)計是目前CAR－T療法的主流。

▲嵌合抗原受體（CAR）結(jié)構(gòu)（圖片來源：《自然》）

二代CAR設(shè)計大多利用抗體單鏈可變片段（single chain variable fragments， scFv） 來識別抗原，目前已經(jīng)有100多種特異性CARs，而且至少有8種共刺激信號受體片段被研究人員使用。其中被研究得最清楚的二代CAR設(shè)計方案是利用CD28和4－1BB共刺激域的CARs。這兩類設(shè)計都已經(jīng)在治療復(fù)發(fā)性B細(xì)胞癌變的臨床試驗中取得了明顯臨床效果。基于CD－28的CARs能夠促進活躍的T細(xì)胞增殖，但是T細(xì)胞持續(xù)性 （T cell persistence） 有限。而基于4－1BB的CARs 誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell） 的能力相對較低，但是支持更長的T細(xì)胞持續(xù)性。

▲CAR家族合成受體成員（圖片來源：《自然》）

利用基因工程對T細(xì)胞的優(yōu)化不只局限在表達不同的CAR或TCR來改變它們的抗原特異性上。與CARs一起表達在T細(xì)胞中的其它人工合成受體可以達到提高T細(xì)胞效力或安全性的作用。這些合成受體包括嵌合共刺激受體（chimeric co－stimulating receptors）、抗原特異性抑制受體（antigen－specific inhibitory receptors）和基于Notch的合成受體。這些合成受體給予研究人員更精準(zhǔn)地調(diào)控T細(xì)胞激活的能力。

CAR－T細(xì)胞在臨床應(yīng)用上的典范：CD19 CAR－T療法

CAR－T療法在臨床上的成功使用不但需要一個強有力的CAR，還需要一個合適的靶點。這個靶點最好在所有腫瘤細(xì)胞表面表達，但是至少不在重要的正常細(xì)胞中表達。CD19因為在大多白血病和淋巴瘤的腫瘤細(xì)胞表面表達而成為一個有潛力的靶點。靶向CD19雖然會造成B細(xì)胞發(fā)育不良，但是短期內(nèi)患者可以耐受，而且清除B細(xì)胞可能阻止針對CAR的抗體的產(chǎn)生。

目前CD19 CAR－T療法已經(jīng)在治療多種B細(xì)胞癌變的臨床試驗中獲得了成功，其中包括急性淋巴性白血?。╝cute lymphoblastic leukemia， ALL）、慢性淋巴性白血病（chronic lymphocytic leukemia， CLL） 和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma）?？上驳氖请m然這些CAR－T療法在CAR設(shè)計、轉(zhuǎn)基因載體以及生產(chǎn)工序上有所不同，但是它們都獲得了非常高的完全緩解率（complete response rate），對ALL的效果尤其出色。

▲CD19 CAR－T療法的臨床試驗反應(yīng)率（圖片來源：《自然》）

值得注意的是同樣的CARs在治療ALL時獲得的完全緩解率要高于CLL和淋巴瘤。目前關(guān)于T細(xì)胞在體內(nèi)分布的臨床數(shù)據(jù)還很少，但是已有數(shù)據(jù)顯示決定CAR－T細(xì)胞的療效的原因更可能是腫瘤微環(huán)境中的抑制分子，而不是T細(xì)胞運輸方面的障礙。

推廣CAR－T療法應(yīng)用范圍需要解決的問題

CAR－T細(xì)胞療法與免疫檢查點抑制劑 （immune checkpoint inhibitors） 是如今給癌癥免疫療法帶來革命性變化的兩類療法。免疫檢查點抑制劑在治療攜帶高度體細(xì)胞突變的腫瘤患者時的療效最佳，而患者的腫瘤如果突變率不高，則對免疫檢查點抑制劑的反應(yīng)不佳。值得一提的是CAR－T療法療效顯著的ALL是一種突變率不高的癌癥。這意味著CAR－T療法可能對那些突變率不高的癌癥和免疫檢查點抑制劑無效的癌癥尤其重要。

▲CAR－T療法（紅色虛線框）和免疫檢查點抑制劑（灰色虛線框）應(yīng)用的癌癥類型（圖片來源：《自然》）

雖然CAR－T療法理論上可以適用于所有癌癥并且可以與其它療法聯(lián)合使用，但是將CAR－T療法推廣到更多癌癥種類中需要以下多個領(lǐng)域的進展：

1． 發(fā)現(xiàn)工程T細(xì)胞的新靶點

在CD19 CAR－T療法取得成功后，在治療血癌方面有兩個新靶點最近接受了臨床試驗的檢驗。它們分別是CD22和BCMA。CD22是一種在癌變B細(xì)胞中表達的B細(xì)胞抑制受體。CD22 CAR－T療法在治療ALL兒童患者中表現(xiàn)出可喜的療效，這些患者的腫瘤已經(jīng)經(jīng)過CD19 CAR－T療法或blinatumomab治療并且復(fù)發(fā)。BCMA是表達在骨髓瘤 （myeloma） 細(xì)胞、正常漿細(xì)胞和部分B細(xì)胞中的TNF受體家族中的一員。BCMA CAR－T細(xì)胞在治療12名骨髓瘤患者的臨床試驗中獲得兩例顯著反應(yīng)。

在治療實體瘤方面，目前發(fā)現(xiàn)的新靶點還存在有不同的缺陷。ROR1、間皮素（mesothelin） 或前列腺特異性膜抗原（prostate－specific membrane antigen， PSMA） 都在部分健康組織中表達。雖然它們在健康組織中表達量很低，但是因此而造成的毒副作用仍然是不能忽視的問題。EGFRvIII是一種在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma）中表達的EGFR拼接變體。它提供了更嚴(yán)格的腫瘤特異性，但是由于在腫瘤中表達水平不一限制了它完全消滅腫瘤的潛力。

基于治療窗口（therapeutic window）和組合抗原識別（combinatorial antigen recognition）的靶向策略有可能幫助彌補這些缺陷。治療窗口策略通過調(diào)節(jié)CAR的表達量或親和力使它們能夠區(qū)分出抗原表達水平的高低，從而在殺傷表達高水平抗原的腫瘤細(xì)胞的同時放過表達低水平抗原的健康細(xì)胞。組合抗原識別策略利用分裂信號受體（split－signaling receptor）、次序作用受體、抑制受體等其它受體與CAR的組合讓T細(xì)胞的激活依賴于多種抗原靶點，從而降低T細(xì)胞的脫靶效應(yīng)。

2． 克服腫瘤微環(huán)境的限制

腫瘤的微環(huán)境不利于T細(xì)胞正常發(fā)揮功能，因為這個微環(huán)境里缺氧、酸化、缺乏營養(yǎng)成份（例如葡萄糖、谷氨酰胺和L－精氨酸），并且充斥著壞死細(xì)胞和一系列免疫抑制分子（例如PD－L1， IL－10， TGFβ和吲哚胺－2－3雙加氧酶）。因此，需要追加步驟來幫助工程T細(xì)胞克服微環(huán)境中的障礙。這些步驟包括使用聯(lián)合療法或者設(shè)計出能夠?qū)姑庖咭种频母行У腡細(xì)胞 。

干擾免疫抑制細(xì)胞或通路的小分子，例如IDO抑制劑、來那度胺（lenalidomide）和腺苷拮抗劑（adenosine antagonist），很可能與工程T細(xì)胞達成協(xié)同作用。BTK抑制劑ibrutinib在臨床前模型中顯示出可以改善CAR－T細(xì)胞功能。免疫檢查點阻斷也可能幫助維持T細(xì)胞功能和持續(xù)性。有多種手段可以用來干擾免疫檢查點蛋白的功能，其中包括阻斷抗體，顯性負(fù)性受體 （dominant－negative receptor） 和靶向基因破壞（targeted gene disruption）。后兩種手段可以依靠對T細(xì)胞的基因工程來完成，從而避免了添加新試劑和增加毒性的風(fēng)險。

▲T細(xì)胞療法設(shè)計的目的和策略（圖片來源：《自然》）

有些幫助工程T細(xì)胞克服腫瘤微環(huán)境的方法明年將進入臨床試驗。這些方法包括讓T細(xì)胞在表達CAR的同時分泌諸如IL－12或 γc細(xì)胞因子或阻斷抑制配體的分子。另外一種方法讓T細(xì)胞持續(xù)表達共刺激配體來增強T細(xì)胞功能。例如表達4－1BB配體不但可以增強T細(xì)胞的固有持續(xù)性，而且可以為周圍的腫瘤浸潤T細(xì)胞提供靶向的共刺激。

3． 選擇哪種T細(xì)胞進行基因工程改造

工程T細(xì)胞的抗癌能力依賴于它們遷移到腫瘤附近，增殖并且殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。因此，除了通過基因工程給予T細(xì)胞對腫瘤抗原的特異性，增強其安全性和有效性以外，T細(xì)胞本身的特性也會對療效有影響。對T細(xì)胞的進一步分析發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞包括初始T細(xì)胞（naive T cell， TN），T記憶干細(xì)胞（memory stem T cell， TSCM），中央記憶T細(xì)胞（central memory T cell， TCM），效應(yīng)記憶T細(xì)胞（effector memory T cell， TEM），組織駐留記憶T細(xì)胞（tissue resident memory T cell， TRM） 和效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell， TE） 等T細(xì)胞亞型。T細(xì)胞的分化過程為從TN逐步分化成TSCM 和TCM，這些細(xì)胞可以自我增殖，并且進一步分化成生存時間較短的TEM和TE細(xì)胞。這一分化途徑意味著選擇分化程度較低的TN， TSCM或TCM作為基因工程的原材料可能產(chǎn)生療效更高的工程T細(xì)胞。

▲工程化T細(xì)胞來源（圖片來源：《自然》）

臨床試驗結(jié)果表明，選擇特定T細(xì)胞亞型生成CD19 CAR－T細(xì)胞，不但可以以較少的細(xì)胞量達成顯著的抗癌效果，而且注入的CAR－T細(xì)胞在體內(nèi)的細(xì)胞擴增程度也比較一致。進一步改進選擇T細(xì)胞亞型的方法和保留分化程度較低的T細(xì)胞亞型的培養(yǎng)方式將是未來臨床研究的方向。

4． 使用同種異體T細(xì)胞的策略

目前為止所有成功的TCR和CAR－T療法使用的都是自體細(xì)胞。這一選擇的原因是為了防止注入的T細(xì)胞攻擊宿主或者宿主排斥T細(xì)胞療法。但是使用自體細(xì)胞不可避免地帶來生產(chǎn)流程上的困難和不同患者之間的療效差異性。使用同種異體T細(xì)胞的挑戰(zhàn)在于如何避免或減少移植物抗宿主病（graft versus host disease， GVHD）。免疫抑制藥物雖然可以減少GVHD的癥狀，但是并不適用于工程T細(xì)胞療法，因為T細(xì)胞的抗癌作用需要不受免疫系統(tǒng)阻礙。

目前有三種防止GVHD的策略：第一種方法移植改造過的造血干細(xì)胞或T細(xì)胞前體而不是成熟的T細(xì)胞，這可以使注入的T細(xì)胞建立起對宿主的免疫耐受。但是這種方法需要患者具有正常的胸腺功能。第二種方法是選擇那些造成GVHD風(fēng)險較小的T細(xì)胞進行改造，例如病毒特異性T細(xì)胞（virus specific T cell， VST）。第三種增加同種異體細(xì)胞安全性的方法是去除這些細(xì)胞中的TCR。這可以通過破壞TCR的α或β鏈來完成。但是這三種手段只能防止CAR－T細(xì)胞不攻擊宿主的健康組織，它們沒有解決宿主的免疫系統(tǒng)排斥同種異體細(xì)胞的問題，因此在臨床應(yīng)用方面的效果有限。

▲多能干細(xì)胞來源的T細(xì)胞（圖片來源：《自然》）

另外一種產(chǎn)生CAR－T細(xì)胞的方法是通過分化多能干細(xì)胞 （pluripotent stem cell）產(chǎn)生T細(xì)胞。干細(xì)胞重編程具有可以無限制地產(chǎn)生用于醫(yī)療的T細(xì)胞的潛力，而且這些細(xì)胞可以接受更多基因工程改造來改善分化出的T細(xì)胞的醫(yī)療潛力。

T細(xì)胞生產(chǎn)工藝方面的改進

用基因工程改造T細(xì)胞從轉(zhuǎn)基因載體開始，反轉(zhuǎn)錄病毒載體（retroviral vectors）目前仍然是TCR或CAR－T細(xì)胞中最常使用的載體。由于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的整合方式是半隨機的，這會導(dǎo)致攜帶的基因表達水平參次不齊。另外一種表達CAR的方法是通過mRNA轉(zhuǎn)染，這種方法導(dǎo)致的基因表達只能持續(xù)幾天。使用靶向核酸內(nèi)切酶 （targeted nucleases） 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可以將表達CAR的基因定向地整合到T細(xì)胞的基因組中。在TCR基因座上表達CAR可能對T細(xì)胞的功能有更多益處。因此，靶向核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因敲除或插入是T細(xì)胞基因工程的發(fā)展方向。

T細(xì)胞的生產(chǎn)過程是一個需要綜合療效、安全性、可重復(fù)性、追蹤性，以及需要滿足監(jiān)管和經(jīng)濟需求的復(fù)雜科學(xué)項目。目前臨床T細(xì)胞的生產(chǎn)過程需要達到FDA的良好生產(chǎn)規(guī)范（good manufacturing practice， GMP） 標(biāo)準(zhǔn)。生產(chǎn)最佳的T細(xì)胞亞型不但可以提高安全性、療效以及可重復(fù)性，而且可以降低完成治療所需的T細(xì)胞劑量，從而降低生產(chǎn)規(guī)模和成本。

目前用于篩選特定T細(xì)胞亞型的GMP抗體不但數(shù)目有限，而且非常昂貴。正在發(fā)展的新科技，包括用聲波捕捉、分離和富集T細(xì)胞亞型，微流控（microfluidics）技術(shù)和相變水凝膠基質(zhì)（phase－change hydrogel substrate） 技術(shù)，可能有助于解決這一問題。這些技術(shù)平臺可以與其它體外富集T細(xì)胞亞型的技術(shù)相結(jié)合，包括使用諸如GSK－3β抑制劑的小分子藥物或者IL－7、IL－15、或IL－21等細(xì)胞因子處理T細(xì)胞。T細(xì)胞療法的興起促進了創(chuàng)新生產(chǎn)平臺的產(chǎn)生和生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的建立。假以時日，這些改變將對所有細(xì)胞療法帶來裨益。

總結(jié)

25年以來，基于細(xì)胞工程和工藝制造的進步，基因增強的T細(xì)胞極大地改善了難治性癌癥患者的療效。其中最引人注目的例子是CD19 CAR－T治療。

然而，人類尚未完全掌握這種全新的治療方式，T細(xì)胞療法仍有很大的優(yōu)化和改進空間。盡管在沒有替代治療方案的B細(xì)胞惡性腫瘤患者中可以獲得高度的完全緩解率，但一半的患者往往會發(fā)生復(fù)發(fā)，這通常是由于抗原損失變體。盡管治療相關(guān)毒性方面取得了進展，但嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性的機制了解甚少，還沒有有效的預(yù)防措施。 因此，需要進一步改善B細(xì)胞惡性腫瘤和其他癌癥的CAR－T療法。

一系列新型靶抗原和CAR設(shè)計將在血液和實體瘤中進行測試。CD19 CAR－T治療在一些白血病和淋巴瘤中的成功是解決其他血液惡性腫瘤的好兆頭。然而，需要確定實體腫瘤中的合適靶標(biāo)（無論是新抗原，癌－睪丸抗原還是非突變的腫瘤相關(guān)抗原），定義用于過繼轉(zhuǎn)移的最佳T細(xì)胞類型，以及解決免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。 此外，需要新的設(shè)備和工藝來降低制造成本。自體T細(xì)胞是目前基于細(xì)胞的癌癥免疫治療的重點，但同種異體細(xì)胞來源，可能包括干細(xì)胞衍生的“現(xiàn)成”T細(xì)胞，在未來可能起重要作用。

雖然最近的突破都聚焦在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，但可以預(yù)期，T細(xì)胞療法將在其他領(lǐng)域獲得更大的發(fā)展。 CD19 CAR－T治療的成功以及治療性T細(xì)胞工程技術(shù)水平的提高，使得細(xì)胞療法應(yīng)用到免疫療法和再生藥物等領(lǐng)域成為可能。